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      RIP-seq是以RNA 结合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay, RIP)为基础,采用特异性抗体对RNA结合蛋白进行免疫共沉淀。沉淀后,分离RNA,通过高通量测序,在全转录组范围内对细胞内RNA与蛋白结合情况进行分析。 RIP-seq可在全转录组范围内揭示RNA分子与RBP相互作用,包括非编码RNA与蛋白的互作。

       
       
       
      应用领域
      1. 特定蛋白特异结合的RNA区域或种类
      2. 不同蛋白结合RNA种类差异分析
      3. miRNA靶向调控基因
       
       
       
      技术路线

       
       
       
      分析内容
       
      1.数据过滤与质量评估:测序质量评估、碱基组成与质量分析、过滤信息统计;
      2.比对统计:比对核糖体、比对参考基因组、基因组测序深度分布、reads在染色体上的分布;
      3.peak分析与注释: peak calling、peak 富集倍数分布、peak 相关基因分析、peak在基因功能元件上的分布、Peak相关基因的GO/ KEGG功能富集分析、peak以及周边基因结构的可视化;
      4. motif分析检测蛋白特异性结合位点;
      5.多样品间的差异分析:样本关系分析、差异peak分析、差异peak相关基因GO/KEGG功能富集分析。
       
       
       
      样品要求
      RIP捕获的RNA>500ng,浓度>30ng/μL,OD260/280为1.8-2.0,OD260/230为1.5-1.8。
       
       
       
      项目周期
      标准流程完成时间为50个工作日。
       
       
       
      参考文献

      1.Zhao J, Ohsumi T K, Kung J T, et al. Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq[J]. Molecular Cell, 2010, 40(6):939

      2.Jayaseelan S, Doyle F, Tenenbaum S A. Profiling post-transcriptionally networked mRNA subsets using RIP-Chip and RIP-Seq[J]. Methods, 2014, 67(1):13-19

      3.Lu Z, Guan X, Schmidt CA, et al. RIP-seq analysis of eukaryotic Sm proteins identifies three major categories of Sm-containing ribonucleoproteins.[J]. Genome Biology, 2014, 15(1):R7

      4.Kidder B L, Hu G, Zhao K. ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data[J]. Nature immunology, 2011, 12(10): 918-922

      5.Nussbacher J K, Batra R, Lagier-Tourenne C, et al. RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive[J]. Trends in Neurosciences, 2015, 38(4):226

      6.Li Y, Zhao D Y, Greenblatt J F, et al. RIPSeeker: a statistical package for identifying protein-associated transcripts from RIP-seq experiments[J]. Nucleic Acids Research, 2013, 41(8):e94

       

       

       

       

       

      Q1RIP-seq和ChIP-seq在分析上有什么差别?

      A:ChIP主要研究蛋白结合的DNA,RIP-seq的研究对象为蛋白结合的RNA。RNA是单链,ChIP-seq所用的双峰查找模式不适用,并且存在链特异性问题。RNA存在选择性剪接事件,需要用剪接比对工具将reads比对基因组。

       

      Q2RIP-seq采用什么方案call peak?

      A:利用专为RIP-seq开发的分析软件--RIPseeker,在转录组范围进行peak扫描(peakcalling),对peak所在基因组的位置信息和peak区域序列信息进行注释,根据注释信息得到peak的相关基因,进而对相关基因进行分析。

       

      Q3为什么RIP实验前需要做WB预实验评估?

      A:因为需要检测抗体的特异性,是否结合目的蛋白;或对目的蛋白条带打质谱鉴定;检测样本中目的蛋白是否有表达及丰度水平。

       

       

      案例一 HNRNPL调控前列腺痉RNA剪接和环状RNA形成

      LNCaP细胞系RIP-seq结果显示,HNRNPL主要结合RNA分子中的CA重复序列或者富含CA的序列,RNAs的峰主要富集在3'UTR和内含子区,暗示HNRNPL参与pre-mRNA的选择性剪接。RNA-seq结果确定了206个选择性剪事件,大部分是外显子跳跃型。circRNA通过pre-mRNA反向剪接产生,RNA-seq结果确定了232个敲低HNRNPL后显著变化的circRNA。HNRNPL结合在内含子侧翼序列会显著增强circRNA的形成,并且敲低HNRNPL显著减少了circRNA的表达。

      图1 前列腺癌细胞系中HNRNPL相关的RNAs

       

      案例二 中风后神经发生相关miRNomes的鉴定

      图2 缺血性NPCs和非缺血性NPCs中Ago2相关的somiRs

      相较于非缺血性神经祖细胞(NPCs),中风改变了NPCs中Ago2相关的miRNAs表达,并且发现了新的miRNAs和m1RNAs异构体(isomiRs),以及多种miRNA-miRNA*配对,其中新的miRNApc-3p-I7I72显著调控NPC增殖和神经分化。lsomiRs在深度测序中可以被检测到,可以在胚胎干细胞中发挥作用。相较千非缺血性NPCs,缺血性NPCs中的isomiRsreads数增加,其中5'末端添加核苦酸的somiR-l42-5p_L+2R-I显著上调,5'末端缺失核苦酸的isomiR-187-5p_L-2R+3显著下调。

       

      参考文献

      [l]Fei T, Chen Y, Xiao T, et al. Genome-wide CRISPR screen identifies HNRNPL as a prostate cancer dependency regulating RNAsplicing.[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 20 I 7, I I 4(26):E5207

      [2]Liu X S, Fan B Y, Pan W L, et al. Identification of miRNomes associated with adult neurogenesis after stroke using Argonaute 2七ased RNA sequencing[J]. Rna Biology, 2016:488-499

       

       

       

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