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      染色质免疫共沉淀测序(ChIP-Seq)是指对染色质免疫共沉淀(ChIP)即使用抗体中和特定的蛋白,富集特异性交联的DNA-蛋白质复合体,然后将寡核苷酸接头与特异性蛋白结合的DNA延伸拼接,进而对染色质免疫共沉淀获得的微量DNA片断进行海量平行测序。

       

      CHIP测序与低分辨率的Chip芯片技术不同,ChIP-Seq经一次测序就准确地进行全基因组的关联分析,实现了全基因组范围内更精确、更敏感、更经济的定位目标蛋白所有的结合位点。可以解决芯片固定数量的阵列特征或候选序列的问题,自由阐释结合事件。

       

      应用领域

      1. 判断DNA链的某一特定位置组蛋白修饰的类型
      2. 精确定位RNA polymerase II及其它反式因子在基因组上结合位点
      3. 组蛋白共价修饰与基因表达的关系的研究
      4. 转录因子结合位点和功能研究

       

      技术路线

       

       

      分析内容

      1. 标准信息分析

      a)对测序结果进行图像识别(Base calling)

      b)去除污染及接头序列;

      c)统计结果包括:测定的序列(Reads)长度、 Reads 数量、数据产量

       

       

       
      2. 高级信息分析
      a)ChIP-Seq 序列与参考序列比对;
      b)Peak calling :统计样品 Peak 信息(峰检测及计数、平均峰长度、峰长中位数);
      c)统计样品 Uniquely mapped reads 在基因上、基因间区的分布情况及覆盖深度;
      d) 给出每个样品 Peak 关联基因列表及 GO 功能注释;
      e)对序列进行Motif分析;
      f)在多个样品间,对Peak进行差异分析;
      g)在多个样品间,对与 Peak 关联基因做差异分析;
       
       

       

      样品要求

      DNA样品需求量:总量≥ 10 ng
      注:请提供DNA打断时的检测胶图,要求打断后的DNA电泳主带在100-500bp范围内,建议在250bp左右。

       

       

      项目周期

      细胞系样品,标准流程的完成时间约为90个工作日;
      免疫沉淀后的DNA样品,标准流程完成时间约为45个工作日;
       

       

       

      参考文献

      [1]Johannes Schödel, Spyros Oikonomopoulos, Jiannis Ragoussis, Christopher W., Peter J., RatcliffePugh and David R. Mole. High-resolution genome-wide mapping of HIF-binding sites by ChIP-seq. Blood June 9, 2011 vol. 117 no. 23 e207-e217

      [2]Michael J. Hitchler and Judd C. Rice. Genome-Wide Epigenetic Analysis of Human Pluripotent Stem Cells by ChIP and ChIP-Seq. Methods in Molecular Biology, 2011, Volume 767, Part 4, 253-267,

      [3]Ionas Erb, Juan R. González-Vallinas, Giovanni Bussotti, Enrique Blanco, Eduardo Eyras and Cédric Notredame. Use of ChIP-Seq data for the design of a multiple promoter-alignment method. Nucl. Acids Res. (2012) doi: 10.1093/nar/gkr1292

      [4]Yiwen Chen, Clifford A Meyer, Tao Liu, Wei Li, Jun S Liu, Xiaole Shirley Liu. MM-ChIP enables integrative analysis of cross-platform and between-laboratory ChIP-chip or ChIP-seq data. genome research 12:R11

      [5]Sylvia C. Hewitt, Leping Li, Sara A. Grimm, Yu Chen, Liwen Liu, Yin Li, Pierre R. Bushel, David Fargo and Kenneth S. Korach. Whole-Genome Estrogen Receptor α Binding in Mouse Uterine Tissue Revealed by ChIP-Seq. Molecular Endocrinology May 1, 2012 vol. 26 no. 5 887-898

      [6]Mariann Micsinai, Fabio Parisi, Francesco Strino, Patrik Asp, Brian D. Dynlacht and Yuval Kluger. Picking ChIP-seq peak detectors for analyzing chromatin modification experiments. Nucl. Acids Res. (2012) doi: 10.1093/nar/gks048

       

       

       

      Q1Input是什么?有什么作用?

      A:将样本DNA片段化之后,我们将DNA分为两份,一份为IP样本(进行免疫沉淀过程),一份为input样本(跳过免疫沉淀步骤,其余步骤与IP样本一致),通过后续的数据分析,我们可以利用input对照消除背景噪音的干扰(排除假阳性peak),因此input样本对于IP类实验十分重要。

       

      Q2样品制备过程中是否需要PCR扩增?PCR扩增后是否会影响最后的结果?还有那些因素会影响ChIP-Seq的结果?

      A:由于ChIP下来的DNA样品量非常少,所以在样品制备过程中需要经过一步PCR扩增的过程,PCR扩增主要是为了获得足够上机反应的DNA量。如果客户能够提供足够量的DNA样品,我们不再进行PCR扩增。由于是线性扩增,扩增前后的结果很相似,基本上不会影响测序结果。抗体的质量,特异性,实验设计,ChIP的实验操作,DNA片段长度范围,测序通量,测序质量等都会影响ChIP-Seq的结果

       

      Q3ChIP-Seq对分析的物种有何要求?

      A:目前可接受的为有参考基因组的人、动物、植物和微生物等。

       

       

       

       

      多组学分析香蕉成熟的调控机制

      合作单位:华南农业大学

      发表杂志:《New Phytologist》

      影响因子IF:7.33

       

       

      研究背景

      果实成熟是一个很复杂的、受到多种转录因子调控的生物学过程。目前关于果实成熟的研究成果和文章非常多,仍然还没完全阐明这个生物学过程。脱水反应元件结合蛋白(DREB)属于AP2/ERF转录因子家族成员,在过往的研究中已被报道在植物抗非生物胁迫过程中发挥着重要作用,但其在果实发育过程中的作用还没被阐明。

       

      研究思路


       

      实验设计

      1. 研究MaDREB受乙烯诱导表达的实验设计:

      三种处理:乙烯处理、乙烯抑制剂1-甲基环丙烯(1-MCP)处理、乙烯和1-MCP同时处理,以及未处理正常成熟对照组的不同成熟时期香蕉样本。

      2.  RNA-seq和ChIP-Seq的实验设计:

      未成熟(乙烯处理前)和成熟(乙烯处理5d)的香蕉样本,三个重复。

       

       

      研究结果

      1.MaDREB基因的表达受乙烯诱导

      RNA-seq结果鉴定出9个DREB基因,通过与其他近缘物种的DREB基因进行序列比对和进化树分析,证明这9个DREB基因是属于转录因子DREB家族成员的。

      图1. qRT-PCR检测MaDREB1到MaDREB4在四种不同处理的香蕉成熟过程中的表达量变化

      图2. GUS和GFP报告实验检测MaDREB1和MaDREB2启动子活性

       

       

      2.ChIP-Seq研究MaDREB2在全基因组范围内的结合区域

      首先制备MaDREB2的多克隆抗体,然后在未成熟和成熟的香蕉果肉中进行染色质免疫沉淀实验,对沉淀下来的DNA进行测序,每组三个生物学重复。三个生物学重复样本的ChIP-Seq结果分别鉴定出1961,1347和1175个peak,其中697个peak是共有的,这697个高度可信的peak用于后续的分析研究(图3 a)。

      MaDREB2的DNA结合位点在全基因组范围内的多个不同区域都有分布,但最主要是在转录起始位点上游2kb内,并且主要富集于TSS附近(图3 b,c)。另外,对MaDREB2结合位点的染色体分布进行研究,发现MaDREB2并不特异结合与某一染色体上(图3 d)。对MaDREB2结合基因进行GO注释,发现参与了多种生物学过程,包括信号转导、植物激素信号通路、细胞间和细胞内信号转导等(图3 e)。

      利用MEME分析MaDREB2的结合motif,共鉴定出三种丰度最高的motif,其中,(A/G)CC(G/C)AC在72.3%的结合位点中都出现(图4),并且与DREB转录因子的经典结合位点DRE/CRT-binding motif ((A/G)CCGAC)高度相似。

      图3. MaDREB2的ChIP-Seq结果

      图4. MaDREB2结合motif分析

       

       

      3.MaDREB2靶基因表达模式分析

      对未成熟和成熟的香蕉果肉进行RNA-seq分析,并联合分析ChIP-Seq和RNA-seq的结果,发现81个(11.6%)MaDREB2靶基因表达量上调,115个(16.5%)MaDREB2靶基因表达量下调,说明这些基因在香蕉成熟过程中受到MaDREB2的直接调控(图5)。

      但是上述的报告基因实验证明了MaDREB2的转录激活活性,这说明MaDREB2也可能具有转录抑制的作用。这些差异表达的基因参与了果实成熟、胁迫应答、转录调控和翻译后修饰等等的生物学过程。

      图5. MaDREB2靶基因与RNA-seq差异表达基因的维恩图

       

       

       

      图6. MaDREB2在香蕉成熟过程中的调控作用

      4.MaDREB2在香蕉成熟过程中的调控作用

      为了找出香蕉成熟过程中受MaDREB2调控的靶基因,在全基因组范围内搜索包含MaDREB2 结合motif (A/G)CC(G/C)AC的基因。共找到23504个基因的启动子区包含至少一个motif,这些基因包括了数个与香蕉成熟两个最显著特性——变软和散发香味相关的基因,如Expansin 1、xyloglucan endotransglycosylase3、alcohol dehydrogenase1等(图6 a)。

      通过ChIP-qPCR来验证MaDREB2与这些基因的结合,结果也显示MaDREB2能够紧密结合在这些基因的启动子区(图6 b)。另外,凝胶迁移实验(EMSA)结果也表明MaDREB2能够结合这些靶基因;所有的这些靶基因的表达量都在香蕉成熟过程中上调(图6 c)。

       

       

      5.MaDREB2能够结合到自身基因的启动子上

      由于从ChIP-Seq结果中发现MaDREB2基因也是MaDREB2转录因子的靶基因,因此利用ChIP-qPCR、EMSA实验来进行验证。结果都证明了MaDREB2能够结合到自身基因的启动子上,表明MaDREB2在调控果实成熟的过程中存在着正向反馈(positive feedback loop)。

      图7. MaDREB2能够结合到自身基因的启动子上

       

       

       

      参考文献

      Kuang, J.-F., Chen, J.-Y., Liu, X.-C., et al. (2017), The transcriptional regulatory network mediated by banana (Musa acuminata) dehydration-responsive element binding (MaDREB) transcription factors in fruit ripening. New Phytol, 214: 762–781. doi:10.1111/nph.14389.

       

       

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