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      蛋白标记定量分析是指利用体外同位素标记(iTRAQ/TMT),对样本进行标记并混合上机检测,可同时比较2-11个样品的蛋白质表达差异,分析不同处理、或不同生理/病理状态下样本中的蛋白表达差异变化,获取蛋白质组分与丰度信息。蛋白标记定量技术具有技术成熟、应用广泛、系统误差较小、实验及数据分析难度低等优点,因此目前已广泛应用与蛋白定量分析。

       

      应用领域  

      1. 不同处理、不同生理/病理状态下样本中的蛋白质表达变化
      2.  蛋白调控网络研究
       
       
       

      技术路线

       

       

       

       

      分析内容

      1. 标准信息分析 2. 定制化信息分析
      a) 数据产出统计
      b) 蛋白数据库建立与PEAKS DB软件搜索
      c) 蛋白质鉴定与定量
      d) 蛋白质功能注释(GO功能、KEGG代谢通路、COG/KOG)
      e) 蛋白质高级注释(蛋白结构域注释、转录因子注释、亚细胞定位分析)
      f) 样本关系分析
      g) 差异蛋白分析(差异火山图、差异比较热图)
      h) 差异蛋白GO/KEGG/DO/Reactome功能富集分析(DO仅限人、Reactome仅限部分物种)
      i) GSEA分析(GO/KEGG/DO/Reactome,DO仅限人、Reactome仅限部分物种)
      a) 蛋白质组与转录组关联分析
      b) 蛋白互作网络分析
       
       
       
       
       
       
       

       

       

      样本要求

      1. 新鲜动物组织:≥200mg
      2. 信息植物组织:≥2g
      3. 新鲜培养细胞:≥5×106个细胞每管,3管
      4. 真菌、细菌:≥200mg
      5. 血清、血浆:150μl × 4管
      6. 体液样本:尿液:5ml ×4管(送样前需1000g离心5min,弃去沉淀),
           其他体液(唾液、羊水、细胞培养上清液等)要求5ml以上。
      7. 蛋白溶液:蛋白总量500μg以上
       

       

       

      项目周期

      标准流程的运转周期约为55个工作日

       

       

       

      参考文献

      [1] Rauniyar N, Yates J R. Isobaric Labeling-Based Relative Quantification in Shotgun Proteomics[J]. Journal of Proteome Research, 2014, 13(12): 5293-5309.
      [2] Chahrour O, Cobice D, Malone J, et al. Stable isotope labelling methods in mass spectrometry-based quantitative proteomics.[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2015: 2-20.
      [3] Luo M, Zhao Y, Wang Y, et al. Comparative Proteomics of Contrasting Maize Genotypes Provides Insights into Salt-Stress Tolerance Mechanisms[J]. Journal of Proteome Research, 2018, 17(1): 141-153.

       

       

       

      Q1: 如何评判样本能否做代谢组或蛋白组(比如-80℃保存了两年、或者用麻醉剂进行处理)?

      A: 针对这种情况要咨询公司销售,评估样本的可检测性。一般情况下,样本-80℃保存半年对蛋白、代谢检测影响不大,可正常使用。如果保存时间更久,可与销售咨询,进行预实验,通过预实验的检测结果判断样本情况。

       

       如果使用麻醉剂等试剂对样本进行预处理,对物质检测结果一定会有影响的。

       

       

      Q2蛋白、代谢检测可否分批送样?

      A: 不建议分批送样,因为仪器稳定性、实验操作人员不同、质谱仪保养清洁等原因会导致不同批次检测结果出现明显的批次效应,且批次效应很难消除,有时批次间的差异会大于样本间的差异。如果真的由于试验需要时间梯度或者样本自身原因,建议先取样,用液氮猝灭后至于-80℃保存,等到所有样本收集完再统一检测。

       

      Q3如何选择蛋白质组检测方法?

      A: 如果研究常规蛋白质组,在样本数少于32个时,建议使用TMT,大于32个时可使用DIA或者direct DIADIAdirect DIA的区分主要在于,direct DIA不需要建库,可直接使用DIA结果进行定性定量,整个项目周短,成本低。

       

       Q4: DIA技术优势这么明显,现在很受欢迎,那蛋白质检测是不是只用DIA就可以?

      A: 并不是,研究人员需要根据研究目的选择更合适的技术。

      如,做常规蛋白质组实验,样本数是16个,我们更建议大家使用TMT

      原因有:1)定量结果更多。对于常规动植物组织,TMT可通过大量的分级(fractionation),提升定量蛋白的数量,而DIA不做分级,定量的结果要低于TMT;

      2)无法发挥DIA稳定性。TMTpro可对16个样本同时标记,混合上机检测,没有平行性的问题。而DIA则是16个样本单独上机检测,DIA的稳定性没有发挥空间。

      3)性价比不高。 DIA的实验流程比较复杂,需先建一个图谱library。在样本数量少的情况下,先花机时完成libirary构建,再花机时进行样本的DIA检测。反而不如一次性做TMT来得经济、快捷。

      如果是样本数较多(大于32个)或者检测血液样本时可优先选择DIA

       

       

       

       

       

      玉米蛋白质组研究盐胁迫

       

      合作单位:北京市农林科学院

      发表期刊:Journal of Proteome Research

      影响因子IF: 4.268

       

       

       

      研究背景

      玉米是世界范围内的主要农作物,而相比于其他作物,玉米对盐的压力较为敏感。盐胁迫是限制玉米产量的主要非生物因素。

      在模式生物拟南芥中,三条通路可以调节盐耐受性。Salt Overly Sensitive通路介导离子体内平衡,而有丝分裂素活化蛋白激酶调节渗透体内平衡,抗氧化防御系统作为一种解毒剂。然而,很少有针对玉米进行耐盐性机制的研究。

       

       

       

       

      实验取材

      耐盐品系Jing724 和敏感品系D9H在无盐(对照)和100 mM盐中培养7天,随后取根进行itraq测序,每组3个生物学重复。

       

       

       

       

       

      研究思路

       

       

       

       

       

      研究结果 

       

       

       

      1.蛋白组分析

       

      利用Mascot软件检测出4328±32.97个蛋白,对Jing724和D9H进行差异分析,对差异蛋白进行聚类分析,发现同一组的样本表现出了相似的表达模式(图1A)。在对照和盐处理条件下,Jing724和D9H共有513个DRPs。

      在Jing724中有127个(34个上调93个下调)DRPs,在D9H中有430个(189个上调241个下调)DRPs。对Jing724和D9H进行韦恩图分析,发现仅44个DRPs是共有的,在Jing724中有83个特有DRPs,在D9H中有386个特有DRPs(图1B)。说明Jing724和D9H两个品系在应对盐胁迫条件下响应的蛋白不同。

      图1.聚类热图和韦恩图

       

      图2. KOG、GO和KEGG注释

      图3.Jing724蛋白互作图

      3.对盐响应DRPs分类

       

      在GO注释中,Jing724和D9H共享了31个GO terms,在这些GO term中,D9H比Jing724有更多的DRPs。

      在Jing724中有2条特有的term——转录因子活性,蛋白质结合(GO: 0000988)和细胞杀伤 (GO: 0001906),而在D9H中,核酸结合转录因子活性(GO:0001071)、活性分子转导器(GO: 0060089)、免疫系统的过程(GO: 0002376)被特有的富集。

       

       

       

      4.分析蛋白质互作

       

      为了确定玉米根细胞如何传递盐胁迫信号,利用String10.5数据库进一步分析Jing724 和D9H的 DRPs。在Jing724 中鉴定出5组互作蛋白,在D9H中鉴定出8组分离的互作蛋白。Jing724和D9H两个品系的互作蛋白调控网络差别较大。

       

       

       

       

       

       

       

      5.响应盐胁迫DRPs的编码基因表达水平

       

      文章挑选6个在Jing724中显著上调的编码DRPs的基因和2个在D9H中显著下调的编码基因进行qRT-PCR验证。结果表明这8个基因的转录模式与蛋白质组分析的结果一致。

       

       

       

       

      小结

       

      通过蛋白质组学揭示两种玉米的耐盐性的水平,发现了513个DRPs。两个品系的玉米在应对盐胁迫的反应不一致,在盐敏感的D9H玉米品系中,下调的DRPs与应激防御和能量供给有关,而上调的DRPs与脂肪酸降解有关。

       

       

      与此相反,Jing724的DRPs主要与戊糖磷酸途径、谷胱甘肽代谢和氮代谢相关。通过比较不同品系间相同处理下的差异,为进一步研究植物对盐胁迫响应和适应的蛋白的重要性提供了基础

       

       

      图4.影响盐胁迫的mRNA表达水平

       

       

       

       

      参考文献

       

      Luo M, Zhao Y, Wang Y, et al. Comparativeproteomics of contrasting maize genotypes provides insights into salt-stresstolerance mechanisms[J]. Journal of proteome research, 2017, 17(1): 141-153.

       

       

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