<sub id="znb55"></sub>
  • <i id="znb55"></i>
      <rp id="znb55"><menuitem id="znb55"></menuitem></rp>
      <ins id="znb55"></ins><ins id="znb55"><noframes id="znb55"><cite id="znb55"></cite>
      <ins id="znb55"></ins><ins id="znb55"></ins>
      <menuitem id="znb55"><span id="znb55"><menuitem id="znb55"></menuitem></span></menuitem>
      <del id="znb55"><noframes id="znb55">
      <ins id="znb55"><noframes id="znb55"><ins id="znb55"></ins><var id="znb55"><span id="znb55"><var id="znb55"></var></span></var>
      <ins id="znb55"><noframes id="znb55"><cite id="znb55"></cite>

       

       

      小RNA是指长度在18-30nt的内源性非蛋白质RNA,广泛存在于高等和低等生物体内,对mRNA的转录及转录后水平等生命过程起调节作用。

       

      小RNA可归纳成三类:miRNA(微RNA),siRNA(小干扰RNA)和与piRNA(piwi相互作用的RNA)。它们以通过沉默和降解其靶点基因分子的方式控制基因表达,在生物体正常生长发育和疾病发生过程中起着不可忽视的调控作用。新一代测序技术提供一套全新独特的,适用于各个物种的小RNA深度鉴定与定量分析的研究平台。通过深度的测序,可以发掘、鉴定并定量出任何物种全基因组水平的小RNA图谱,推进了对小RNA功能的研究。

       

      应用领域

      1. 基因转录后调控研究
      2. 基因沉默研究
      3. small RNA靶标分析和调控网络

       

      技术路线

       

       

      分析内容

       

       

      样品要求

      样品类型:完整且无污染的总RNA
      样品需求量:≥10 μg 样品浓度:≥200 ng/μl
      样品纯度:植物RIN≥7.5,28s/18s≥1.3;动物RIN≥8.0,28 S/18 S≥1.5
      血清/血浆RNA或免疫共沉淀RNA等特殊样品,请提供浓度≥1 ng/μl、总量≥50 ng的样品(至少需要5 ml血清)。要求蛋白等杂质污染较少,不影响正常PAGE分离
      Small RNA(<200nt)样品浓度≥20ng/μl、总量≥1μg。

       

      项目周期

      标准流程的运转周期约为45个工作日

       

       

      参考文献

      [1] Yue Li, Zhuo Zhang, Feng Liu, Wanwipa Vongsangnak, Qing Jing and Bairong Shen. Performance comparison and evaluation of software tools for microRNA deep-sequencing data analysis. Nucl. Acids Res. (2012) doi:10.1093/nar/gks043
      [2] Shahar Alon, Francois Vigneault, Seda Eminaga, Danos C. Christodoulou, Jonathan G. Seidman, George M. Church and Eli Eisenberg. Barcoding bias in high-throughput multiplex sequencing of miRNA. Genome Res. 2011. 21: 1506-1511
      [3] Stefano Volinia, Marco Galasso, Maria Elena Sana, Timothy F. Wise, Jeff Palatini, Kay Huebner, and Carlo M. Crocea. Breast cancer signatures for invasiveness and prognosis defined by deep sequencing of microRNA. PNAS February 21, 2012 vol. 109 no. 8 3024-3029
      [4] Joseph M. Dhahbi1, Hani Atamn, Dario Boffelli, Wendy Magis, Stephen R. Spindler, David I. K. Martin. Deep Sequencing Reveals Novel MicroRNAs and Regulation of MicroRNA Expression during Cell Senescence. PLoS ONE 6(5): e20509. doi:10.1371/journal.pone.0020509
      [5] Rui Liua, Chunni Zhang, Zhibin Hud, Gou Lia,eta. A five-microRNA signature identified from genome-wide serum microRNA expression profiling serves as a fingerprint for gastric cancer diagnosis. European Journal of Cancer Volume 47, Issue 5, March 2011, Pages 784–791
       
       

       

       

       

       

       

      Q1:没有参考基因组的物种,可以做small RNA测序吗?

      A:无参考基因组的物种可以开展small RNA测序研究。

       

       

      Q2:测序结果怎么去掉一些其他的RNA,诸如rRNA,tRNA之类的?

      A:比对Rfam数据库,比对到的为rRNA或者tRNA,去掉即可。

       

       

      Q3:怎么分析miRNA在其他物种的保守性?

      A:在其他物种中找些保守miRNA,自己研究的物种找些保守的miRNA,进行blast比对。

       

       

      Q4:能不能用small RNA测序的结果分析tRNA?

      A:不能。转移RNA(tRNA)是普遍表达的非编码RNA,长度为70-90个核苷酸(nt),tRNA有稳定的三级结构和高度的碱基修饰,甲基化、核苷内的转位反应、还原反应(tRNA功能发挥所必须的)。这些都是tRNA的特点。

       

       

       

      RNA揭示血管平滑肌细胞损伤修复机制

      合作单位:广州市妇女儿童医疗中心

      发表期刊:Journal of Clinical Investigation

      影响因子:13.251

       

      研究背景

      当我们的血管受到损伤时,最初的反应是维持凝块形成、血管收缩和细胞增殖从而止血,这种即时反应主要由血栓素和PDGF等物质介导,这些物质是从活化的血小板中释放,并促进VSMC(血管平滑肌细胞)去分化。

       

      但当损伤修复后,VSMC的去分化不减弱就会发生大量的内膜增生,因此又需要预防过渡修复(即将VSMC切换回分化的静止状态)。血管损伤的修复和预防过度修复的过程涉及VSMC去分化和分化。

       

      实验方法

      血管平滑肌细胞(VSMC)空白组,与血小板共培养的处理组,每组三个重复进行miRNA测序。

       

      研究思路

      作者通过发现与预期不符的结果,提出miRNA可能在其中起的作用,对miRNA及其靶基因进行验证,最终发现了VSMC损伤修复的模型。

      研究结果

      1.发现问题—血小板诱导VSMC分化

      在最开始的实验中,作者将活化血小板(APs)和人主动脉血管平滑肌细胞VSMC共培养,预期的结果是血小板会诱导VSMC去分化。但结果却出乎意料,经APs共培养的VSMC的分化标志物的蛋白表达明显高于静止血小板共培养(RPs)和无血小板共培养(Ctrl),同时VSMC去分化标志物同时显著降低(图1),表明活化的血小板反而诱导了VSMC的分化。

       

      图1. VSMC的分化和去分化标志物的表达情况

       

      2.找到原因—活化的血小板将mirna转移到VSMC中以抑制VSMC的去分化

      作者对与血小板共培养(APs)或空白组 (control)的VSMC进行miRNA测序。通过miRNA测序找到许多差异表达的miRNA,在其中找到关键miRNA:miR-223,miR-143/145。

      为进一步验证miRNA的作用,作者使用前列环素(防止血小板活化)或RNase A(降解RNA)预处理血小板,结果发现会显著降低VSMCs中miR-223和miR-143/145的表达(图2C),而前列环素和RNase A的预处理会显著降低APs对VSMCs的促分化作用(图2D)。

       

       

      3.寻找miRNA的靶基因

      作者通过生信分析和荧光素酶报告基因检测,发现了miR-143、miR-145和miR-223的靶基因KLF4、KLF5和PDGFRβ。

      为了进一步证明血小板miR-143、miR-145和miR-223确实对VSMC表型转换至关重要,作者进行了挽救实验。作者发现在共培养早期(6-12小时),血小板释放的PDGF促进VSMC增殖, miR-223在VSMCs中积累。随后(24 - 48小时), VSMCs利用miR-223抑制细胞增殖及靶基因PDGFRβ的表达 (图3)。

      综上所述,这些数据表明血小板释放的miRNA是VSMC转化的主要调控因子。

      图3.细胞增殖率、miR-223和PDGFRβ的表达情况

      图4. 受伤股动脉的VSMCs 中PDGFRβ的表达情况

      4.验证靶向关系

      作者在受伤和未受伤的股动脉中进行了miR-223抑制试验。在未受伤的血管中,PDGFRβ的表达很低。在损伤后4周,相比于对照组,miR-223 被抑制的实验组中PDGFRβ的表达上调(图4)。这些结果表明, PDGFRβ的确是miR-223的靶基因。

      5.在糖尿病患者中推测理论

      在糖尿病等病理条件下,血小板中的miRNA水平会发生改变,而作者研究观察到患糖尿病(DM)的人和小鼠的血小板中miR-223的表达降低(图5),因此作者对DM和WT小鼠进行研究,通过荧光原位杂交发现,在DM条件下,尽管血小板被内化到VSMCs中,但血小板中的mirna水平转移明显减少,并且导致它们的靶基因在体内的表达增加。

      这些结果与之前的体外研究结果一致,即血小板来源的miR-223水平转移到VSMC,通过下调PDGFRβ从而抑制VSMC的去分化。但DM的条件下, miR-223 的表达降低,PDGFRβ的表达增加,导致血管平滑肌细胞增殖和内膜的增生。

       

      图5.miR-223在健康受试者和DM患者、非DM小鼠和DM小鼠血小板中的表达

      图6.VSMC损伤修复模型

      6.模型——提出了正常和DM血小板中mirna转移到受损血管VSMCs的模型

      通过上述一系列的研究,作者提出了VSMC损伤修复机制的模型:在正常生理过程中,内皮屏障是完整的,血小板是静止的,与VSMC没有相互作用。当受到损伤时,内皮屏障受损,暴露内皮下层,导致血小板活化。

      除了血栓形成外,还释放出可启动伤口修复的药物,包括诱导VSMC脱分化和细胞增殖。激活的血小板随后被VSMC吸收,并释放miR-223以及其他如miR143/145,这些miRNA对VSMC脱分化起抑制作用,转而向VSMC分化。后续延迟反应会阻止VSMC的过度修复,从而减少内膜增生。但在miR-223减少的DM血小板中,VSMC会发生过度增殖导致内膜的过度增生。

      小结

      作者首先从前期实验发现了与预期相反的结果中提出了假设:可能存在miRNA在其中起作用,随后找出可能起作用的miR-223,并对其验证;接着寻找miR-223的靶基因PDGFRβ,并验证了靶向关系,从而推测出VSMC损伤修复的模型。

      除了在正常水平下,作者还想到了糖尿病的情况下miRNA的表达会降低,从而推测出糖尿病情况下VSMC的损伤修复模型。在一步步的抽丝剥茧中将VSMC损伤修复的机制完整的展现出来,是一个非常值得借鉴的文章思路。

      参考文献

      Zeng Z, Xia L, Fan X, et al. Platelet-derived miR-223 promotes a phenotypic switch in arterial injury repair[J]. The Journal of clinical investigation, 2019, 129(3): 1372-1386.

       

       

      任你躁在线精品免费,天天摸天天做天天爽视频,男女免费观看在线爽爽爽视频,亚洲欧美中文日韩在线v日本 网站地图