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      长链非编码RNA(long non-coding RNA, LncRNA)是近年来引起广泛关注的一种具有独特的调控功能的非编码RNA。LncRNA的长度在200nt以上,不编码蛋白,物种间保守性较差,有的序列结构与mRNA相似(含有polyA尾,存在可变剪切),有的则无这些特征。目前的研究对LncRNA的产生和功能机制尚未有明确的认识,但已有多种具有重要生物功能(如癌症发生、X染色体沉默以及与其他调控因子作用构成复杂调控网络等)的LncRNA被发现。
       
      基迪奥生物使用高通量测序的方法,可以在样品totalRNA中大量、快速的筛选lncRNA,并对其进行注释与功能预测。
       
       
      应用领域
       
      1. 新lncRNA找寻与预测
      2. 疾病研究
      3. 调控网络研究

       

      技术路线

      分析内容

      1. 标准信息分析
      a) 测序数据评估;数据比对统计,测序饱和度分析,测序随机性的统计分析,Reads在参考基因上的分布分析
      b) 已知 lncRNA 的识别与注释
      c) 转录本重构与新lncRNA预测
      d) LncRNA 表达量的统计
      e) LncRNA 样本关系分析
      f) LncRNA差异分析
      g) LncRNA 家族分析
       
      2. 高级信息分析
      a) lncRNA 位置分类(Intergentic lncRNA,Intronic lncRNA,Cis-antisense lncRNA)
      b) 候选lncRNA的保守性分析
      c) 贯穿分析(需同一样品的不同水平数据,如跟sRNA测序结果关联。可参考miRNA-TF-gene network分析方案, 或者miRNA-LncRNA关联分析)
      d) 候选基因分析(某种表达模式基因或者非编码基因,或者转录因子,需指定)
      e) 定制图表(可按老师提供的参考文献或者要求制作)
      f) 定制个性化分析(老师提供方案或者参考文献)
       

       

       

       

      样品要求

      A类:总RNA≥10 μg(浓度≥300 ng/μl,纯度:OD260/280 =1.8~2.2;OD260/230 ≥2.0;RIN ≥ 7.0,28S:18S ≥1.0)
      B类:总RNA为5~10 μg(浓度≥300 ng/μl,纯度:OD260/280 =1.8~2.2;OD260/230 ≥2.0;RIN ≥ 7.0,28S:18S ≥1.0)

       

       

       

      项目周期

      标准流程的运转周期为45个工作日

       

       

       

      参考文献

      [1] Zheng W , Chen C , Chen S , et al. Integrated analysis of long non-coding RNAs and mRNAs associated with peritendinous fibrosis[J]. Journal of Advanced Research, 2018.
      [2] Liu Q , Kong Y , Han B , et al. Long Non-coding RNA Expression Profile and Functional Analysis in Children With Acute Fulminant Myocarditis[J]. Frontiers in Pediatrics, 2019, 7:283.

       

       

       

       

       

      Q1lncRNA测序对物种有什么要求?为什么需要构建链特异性文库?

      A:LncRNA测序要求所研究的物种必需有参考基因组。构建链特异性文库的原因:很多基因在基因组上具有正负链的转录本,反义转录是真核基因的一个特征,是一种重要的调控方式。使用链特异性文库能够保留RNA的方向性信息,可以确定转录本来自正链还是负链,以便更加准确的获得基因的定性结果以及基因表达信息。

       

       

       

       

      Q2怎么发现新的lncRNA?

      A:组装→算法→进行预测

       

       

       

       

      Q3lncRNA可以在原核中做吗?                    

      A:纯分析的角度是可以的。但是关于原核生物lncRNA的文献报道还比较少,所以原核生物上做lncRNA还是存在一定风险。

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

      蓖麻籽lnc-RNAs表达网络与遗传模式的差异分析

      合作单位:中科院昆明植物研究所

      发表期刊:The Plant Journal

      影响因子IF:5.901

       

      研究背景

      蓖麻是非常重要的经济作物,此前作者与基迪奥合作已经收获了两篇高分文章,文章1进行了蓖麻籽基因组印记的研究(IF:8.8),文章2 进行了胚与胚乳甲基化差异机制的研究(IF:6.8)。

      这一次作者紧跟lncRNAs的研究热点,首先从lncRNAs差异表达及功能特征揭示其对胚与胚乳发育的调控,然后将文章1、文章2研究思路应用于lncRNAs的研究,从甲基化和基因组印记角度进一步揭示lncRNAs的差异机制。

      该系列研究从2013年启动以来,基迪奥生物长期持续地为合作方提供个性化生物信息服务,有力辅助了该项目持续产出三篇文章。

       

      研究思路


      图1.研究思路

       

      研究结果

      1.lncRNAs功能分析

      1.1 lncRNAs特征

      10个样本序列组装过滤后获得5356lncRNAs,平均长度为803 nt。与拟南芥、水稻、等已知lncRNAs相比,蓖麻籽lncRNAs序列保守性极低,但位置保守性较高。16.3% lncRNAs与转座子序列重叠(TE-lncRNAs)。

       

       

      1.lncRNAs功能分析

      1.1 lncRNAs特征

       

      10个样本序列组装过滤后获得5356lncRNAs,平均长度为803 nt。与拟南芥、水稻、等已知lncRNAs相比,蓖麻籽lncRNAs序列保守性极低,但位置保守性较高。16.3% lncRNAs与转座子序列重叠(TE-lncRNAs)。

      1.2 lncRNAs与PCgenes关联

      胚、胚乳组织中,lncRNAs的表达量显著低于PCgenes的表达量。作者鉴定了顺式(500 bp < 距离 < 5kb)和反式(距离 > 5 kb)lncRNAs与PCgenes、PCgenes启动子的pair(图2c),相关性分析呈现了较强的正相关(图2d、2e)。

      图2 lncRNAs与PCgenes pair数目和相关性

       

       

       

       

      图3 胚、胚乳中转录本(lncRNAs和PCgenes)共表达分析

      a.转录本基因表达量热图  b.WGCNA分析的层次聚类树 c. 模块与组织特征的相关性 

      e.darkorange模块的部分网络图,蓝色与绿色分别表示lncRNAs和PCgenes

      1.3 胚、胚乳转录本表达量差异

      相对于PCgenes,lncRNAs的组织特异性更高(图3a),暗示胚、胚乳的发育差异源于转录本的表达量差异,尤其是lncRNAs。权重基因共表达网络分析(WGCNA)获得13个模块(图3b),其中2个模块(图3c)与胚和胚乳的关联最显著:

      1)模块darkorange含在胚中高表达的转录本,主要为核糖体合成组装,RNA剪切、转运、降解等代谢,4种核心lncRNAs(图3e)关联的PCgenes与调控胚发育的转录因子相关;   

      2)模块orange含在胚乳中高表达的转录本,主要为碳、氮、氨基酸、黄铜合成等代谢,核心lncRNAs关联的PCgenes与糖酵解相关。

      2.DNA甲基化对lncRNAs的调控

      除了从lncRNAs功能角度分析样本差异,作者还从lncRNAs被调控的角度更深入揭示上游DNA甲基化对样本差异的影响。

      胚乳中lncRNAs与PCgenes的 CG和CHG甲基化水平都低于胚,但胚乳和胚中CHH甲基化水平相近(图4a)。比较lncRNAs及其上下游2kb区域内甲基化水平与表达量的关系,作者发现lncRNAs表达量与三种甲基化水平都呈负相关(图4b)。同时,胚体外实验证明,去甲基化处理后84.4%的lncRNAs表达量上调(图4c)。

      图4  a.胚、胚乳中转录本(lncRNAs和PCgenes)甲基化水平分析(En, 胚乳;Em,胚)

      b. lncRNAs表达量与甲基化水平对比 c.胚体外甲基化实验lncRNAs表达量

      图5 不同杂交系胚乳中等位lncRNAs的表达量

       3.lncRNAs的遗传模式

       

      除了被DNA甲基化影响,作者认为lncRNAs的表达也有自己的遗传模式,如基因组剂量效应、亲源效应等。

       

      3.1 基因组数量与来源对lncRNAs的影响

      基于SNPs分子标记统计不同亲本来源lncRNAs表达量,结果显示,胚乳中,部分符合预期母本与父本2:1的比例(因为胚乳为3倍体,含母本基因组2份,父本1份)(图5a),暗示基因组剂量效应对lncRNAs表达量有影响。对于小部分的偏差,作者补充了亲源效应分析(图5b),发现当亲本中lncRNA表达量差异很大时,就会影响子代中母本与父本来源lncRNAs表达量的比例。

       

      3.2 印记lncRNAs的鉴定与聚类

      研究获得20个母本印记lncRNAs,以及新的56个亲本印记PCgenes。4种 lncRNAs验证实验显示,

      3个符合预期的母本印记,1个表现出不完全印记(图6)。

      图6 印记lncRNAs的表达量验证

      小结

      作者充分利用前两篇文章中甲基化与基因组印记的成果和经验,在此篇文章中结合lncRNAs数据进行了全面系统的差异分析,使生物学问题的研究更加充分深入,获得主要成果如下:

      1. 从lncRNAs丰度和功能角度初步揭示了造成胚、胚乳差异发育的原因;

      2. 从DNA甲基化水平初步揭示了lncRNAs差异表达的原因;

      3. 从基因组剂量效应、亲源效应、基因组印记方面揭示了lncRNAs的遗传模式。

       

      参考文献

      Xu W, Yang T, Wang B, et al. Differentialexpression networks and inheritance patterns of long non‐coding RNA s in castorbean seeds[J]. The Plant Journal, 2018.

       

       

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