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      原核转录组测序分析是专业针对原核微生物设计开展的转录组学研究。微生物在特定生境或时期中会表现出基因表达差异性,以此应对环境变化。经过去除核糖体RNA、构建链特异性文库等实验步骤,最终获得特定时期或者环境下微生物体内所有转录本(包括mRNA,非编码RNA等)的表达量差异和结构信息,以及功能特征,从而找出关键功能基因,解答更多微生物功能谜题。

       

       

       

      应用领域

      1. 探究微生物不同时期、不同表现型、应激响应等相关的分子调控机制。
      2. 完善微生物转录组信息,如转录本结构、新转录本预测,非编码RNA预测等。

       

       

       

      技术路线

       

       

      分析内容

      1. 测序数据质控

      2. 比对参考基因组

      3. 已知基因表达量统计

      4. 样本关系分析

      5. 差异基因富集分析(两个或两个以上样本)

      5.1差异表达基因筛选

      5.2 差异基因散点图与火山图

      5.3 差异基因表达模式聚类分析(热图)

      5.4 差异基因GO功能显著性富集分析

      5.5 差异基因Pathway显著性富集分析

      6. 新转录本预测

      7. 转录本结构分析

      转录起始/终止位点预测;

      操纵子预测;

      启动子预测;

      5' UTR核糖体结合区(SD)序列预测 ;

      3' UTR ρ-independent终止子预测

      8. 反义转录分析

      9. sRNA分析

      sRNA预测;
      sRNA注释;
      sRNA表达量差异分析;
      10. 基因结构circos图
      11. 高级分析:sRNA靶基因预测及关联分析

       

       

       

       

      样品要求

      1.浓度≥100ng/μL,总量≥4μg的RNA
      2.OD260/ 280介于1.8 ~ 2.2之间,OD260/230≥2.0,RIN值≥6.5,23S:16S≥1.0。
      3. 在运输前将所有样品管固定于50 ml带盖离心管,干冰运输。

       

       

       

      项目周期

      标准流程的运转周期为45个工作日

       

       

       

      参考文献

      1. Kröger C, MacKenzie K D, Alshabib E Y, et al. The primary transcriptome, small RNAs and regulation of antimicrobial resistance in Acinetobacter baumannii ATCC 17978[J]. Nucleic acids research, 2018, 46(18): 9684-9698.
      2. Liu X, Shen B, Du P, et al. Transcriptomic analysis of the response of Pseudomonas fluorescens to epigallocatechin gallate by RNA-seq[J]. PloS one, 2017, 12(5): e0177938.

       

       

       

       

      Q1原核物种没有参考基因组,可以做无参转录组分析吗?

      A:一般不建议做。因为原核生物的mRNA一般为多顺反子,直接拼接效果较差,对后续数据分析影响很大。

       

       

      Q2原核转录组与真核转录组建库有什么区别?

      A:真核生物mRNA有polyA尾巴,可用poly dT富集真核生物mRNA,另外真核生物的基因组通常比较大,一般只有正义链上有基因,所以真核生物采用polyA富集建库方式即可。而原核生物mRNA 没有 polyA 尾巴,需要用去核糖体RNA的方式富集mRNA。另外,原核生物基因组利用率较高,基因组中正负链上都存在较多基因,所以我们建库时需要区分原核生物的正负链信息,我司原核生物的建库方式是去核糖体链特异性建库。

       

       

       

       

       

      原核转录组分析燃煤烟气废水处理机制

      合作单位:广州大学

      发表期刊:Journal of Cleaner Production

      影响因子IF:6.395

       

      研究背景

      燃煤电厂的烟气脱硫过程产生的废水中含有浓硫酸盐,氯化物,金属和难溶的有机化合物,会导致严重的污染和腐蚀问题。生物脱硫工艺SANI (Sulfate reduction, Autotrophic denitrification and Nitrification Integrated)集硫酸盐还原、自养反硝化、硝化作用于一体,不需要添加重金属捕集剂和强氧化剂等高成本试剂,能有效解决传统烟气脱硫所带来的污染问题。生物脱硫工艺使用特定菌株进行烟气进行脱硫,开发高效脱硫菌株有助于提高生物脱硫工艺的效率。

       

      研究思路

      实验方法

      收集发电厂的脱硫废水, 化学沉淀之后进行废水微生物脱硫处理。采用三个并联运行的1 L 厌氧S B R(operated sequencing batch reactor)反应器。在引入预处理的脱硫废水之前,将硫酸盐还原菌株B Y7、S R10、S R 3分别接种至三个反应器中,共进行30天的污水注入处理。每天检测重金属、硫酸盐、卤素、难降解有机物去除效率等生化指标,提取细菌RNA,分析脱硫处理前后三类细菌差异表达基因,MIDI系统检测脱硫前后三类细菌的膜脂肪酸组成差异。

       

      研究结果

      三类硫酸还原菌降污效果评估

      检测三类还原菌(BY7、SR10、SR3)对污水中硫化物等指标的去除效果,菌株BY7和SR10的硫酸盐还原菌能够适应高盐度烟气脱硫废水,具有很高的硫酸盐还原率(86-94%),各类重金属去除率(70-100%)和难处理的有机物去除率(85–95%) 。

       

      原核转录组分析-菌株降污分子机理

      使用原核转录组深入分析废水脱硫处理前后细菌基因差异表达,寻找潜在响应高盐废水的基因,解释细菌耐高盐及降解污染物的分子机理。BY7、SR10两个菌株处理前后差异表达基因(差异表达基因(DEG)筛选标准:FC>2、FDR<0.05)数量分别为5231和5600个。其中,受废水盐胁迫上调基因数量分别为3124和3030,分别占BY7、SR10两菌株差异基因总量的60%与54% 。

      通过差异基因GO富集分析,发现BY7、SR10中上调基因多富集于生物调节、代谢过程、生物膜及膜相关生物过程。通过KO富集分析,发现抗生素生物合成、次级代谢物生物合成、嘌呤代谢、氨基酸生物合成、碳代谢等相关途径发生了显著变化。(图2)

       

      图2 差异基因GO富集分析

       

      脂肪酸积累检测-研究菌株抗逆代谢机理

       

      图3 处理前后代谢物柱状图(编号代表对应代谢物信息)

      为进一步研究细菌对脱硫废水的响应调节代谢机理,使用MIDI检测了脱硫废水处理前后硫酸盐还原菌的脂肪酸组成 。经检测发现,单不饱和脂肪酸C17:1 ω7c 、C18:1 ω9c 等在BY7、SR10两个菌株反应器中的积累量显著上升。细菌脱硫过程中,总体上饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸丰度增加,异支链脂肪酸减少,整体趋势与脱硫弧菌的研究一致(图3)。

       

      小 结

      1)通过转录组从基因水平解释两个菌株的抗逆、降污机理:逆境下大量代谢、膜相关、抗逆相关基因显著高表达,代谢物合成、抗生素合成等通路在高盐逆境中被激活。说明逆境下菌体能通过调控一系列基因、激活通路等手段,稳定自身,加速代谢,降解污水中的污染物质。

      2)通过检测脂肪酸代谢物进一步研究逆境中的代谢机制:单不饱和脂肪酸等代谢物积累量在逆境显著提升,用于维持菌体生物膜的高速转运,保证菌体能够维持形态、PH等生理指标在正常水平范围内。

       

       

       

      参考文献

      Yan J, Yuan W, Liu J, et al. An integrated process ofchemical precipitation and sulfate reduction for treatment offlue gasdesulphurization wastewater from coal-fired power plant[J]. Journal of Cleaner Production, 2019, 228: 63-72.

       

       

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